熒光免疫層析工藝流程

熒光免疫層析技術（FICA）是基于抗原抗體反應和層析現象的新型膜檢測技術。相較于膠體金技術，熒光免疫層析技術有著可定量分析和高靈敏度等特點，與此同時在試紙條制備上也有著更高的操作要求。簡單為大家介紹一種熒光免疫層析工藝流程（僅供參考）

抗體標記

1. 清洗

檢查熒光微球溶液外觀，確保無凝聚、無漂浮物等變質情況。將熒光顆粒吹打混勻，量取50ul（0.5mg），加入至2ml干凈、已烘干的圓底離心管中，加入500ul清洗液吹打混勻，低溫16000r/min離心10min除去上清。

2. 活化

用活化液分別配制EDC溶液和NHS溶液各5ul（0.1mg）。取190ul活化液重懸熒光微球，吹打混勻。分別加入上述EDC溶液和NHS溶液成200ul體系，吹打混勻，水浴超聲5min。37℃，200r/min振蕩孵育30min后低溫16000r/min離心10min除去上清，分別用300ul和500ul活化液重懸、離心清洗一次。

3. 偶聯

在活化、清洗后的熒光微球中加入一定體積的標記液（V=抗體標記體系體積200ul-標記抗體體積）重懸微球，加入標記抗體0.05mg（由濃度換算成體積），吹打混勻，水浴超聲5min后37℃恒溫振蕩16000r/min*3h。

4. 封閉

加入已對半稀釋的200ul0.125%封閉液吹打混勻，水浴超聲5min后37℃，100r/min恒溫振蕩30min；再加入已對半稀釋的400ul0.063%封閉液吹打混勻，水浴超聲5min后37℃，100r/min恒溫振蕩30min。

5. 保存

低溫14000r/min*10min離心除去上清，加入100ul室溫保存液重懸（微球終濃度5mg/ml，抗體終濃度0.5mg/ml），吹打混勻。

處理結合墊

根據需要使用含不同組分（表面活性劑、封閉劑、保護劑）的緩沖液處理包被PVA的玻纖，37℃烘干。

緩沖液如：磷酸緩沖液、Tris、硼酸緩沖液、碳酸緩沖液、生物緩沖液等；

表面活性劑如：Tween-20、Tritonx-100、S9等；

大分子（封閉、保護）如：PEG4000、PEG20000、PVP、PVA等；

小分子（保護）如：糖類物質（蔗糖、海藻糖等）；

惰性蛋白（封閉）如：BSA、OVA、Casein、Casein-Na等。

噴涂標記抗體

根據項目檢測特點用保存液稀釋標記抗體-微球至合適濃度，選擇性使用獨立質控抗體一同噴涂在標記墊上；設置劃膜噴金儀噴涂參數，預實驗建議為2ul/cm，在結合墊上噴涂標記抗體，37℃烘干4h。

劃線包被抗體

根據項目檢測特點選擇合適的包被抗體濃度，根據項目及所用抗體情況選擇C線的二抗，設置噴涂參數。預實驗建議為1ul/cm，劃線后37℃過夜烘干。

組板

將吸水墊和制備好的標記墊、樣品墊貼在硝酸纖維素膜上，根據檢測卡殼卡槽大小裁剪試紙條。

包裝

將裁切好的檢測條壓入檢測卡殼內。

注意事項

1.熒光微球清洗后上清液應該保證澄清，不應該渾濁；
2.EDC溶液和NHS溶液要先配現用，配好的溶液應無團聚；
3.超聲過程中液體會濺到管壁上，需要間斷地輕甩離心管；
4.偶聯加入抗體時應無顆粒狀沉淀產生；孵育時每隔半小時觀察是否有沉淀產生，如有，可水浴超聲5min；
5.標記完成后4℃保存，過夜后觀察應無沉淀。
6.項目不同、檢測指標要求不同，工藝需要做適當調整，可參考免疫層析工藝常見問題及解決方法。